Putfa051′s Weblog

PCR untuk diagnosis Pertussis (in my opinion)

Multitarget PCR untuk Diagnosis Pertussis dan Implikasi Klinisnya

Pertussis adalah infeksi saluran pernafasan yang disebabkan oleh infeksi Bordetella pertussis, infeksi oleh B. parapertussis jarang terjadi. Tingkat penularan pertussis tinggi sehingga diagnosis pertussis yang tepat pada waktunya dan dapat dipercaya menjadi penting dalam hal menyediakan terapi spesifik dan pencegahan penularan penyakit. Macam-macam metode diagnosis telah dikembangkan untuk mendeteksi pertussis, tetapi semuanya terbatas dalam hal sensitivitas, spesifitas, dan kepraktisan. Penemuan kembali organisme melalui kultur atau metode direct fluorescent antibody (DFA) memiliki spesifitas yang tinggi, tetapi sensitivitasnya rendah dan hasilnya tidak tersedia degna cepat. Penelitian serologic, meskipun tidak praktis untuk diagnosis cepat, telah digunakan untuk mengukur antibody IgG terhadap racun pertussis berhasil dalam sebuah investigasi besar-besaran yang meliputi remaja dan dewasa sebaik percobaan vaksin. Pemeriksaan antibodi spesifik pertussis dalam serum tidak pernah diterima secara luas dalam wilayah klinis karena hasil serologik tidak dapat digunakan atau tersedia dengan cepat menyebabkan keraguan dalam proses penyakit, khususnya dalam infansi dan tidak selalu dapat membedakan host imunitas yang diperoleh setelah infeksi atau vaksinasi.

Uji PCR secara substansi memudahkan diagnosis pertussis. Uji PCR dapat diterapkan secara langsung pada spesimen, dapat mendeteksi meskipun hanya sedikit atau kadang-kadang organisme Bordetella yang mati, menyediakan hasil dengan cepat, dan dapat dilakukan pada infant. Uji ini lebih sensitive daripada kultur, dengan tingkat sensitivitas dan spesifitas berturut-turut 61 dan 88%.

PCR untuk diagnosis pertussis sudah diperkenalkan sejak tahun 1989, Namun agen pengaturan di Amerika Serikat (Euperstrain) tidak merekomendasikannya karena pernah dilaporkan hasil false negatif dan false positif hingga “pseudo outbreak” yang terjadi karena penanganan laboratorium yang salah dan prosedur percobaan dibawah optimal. Namun demikian Laboratorium Mikrobiologi pada Rumah Sakit Anak dan Pusat Kesehatan Wilayah (CHRMC), Seattle, WA, menganjurkan penggunaan two-target PCR untuk diagnosis pertussis. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan pengunaan multitarget melawan sekuens IS481 (IS), racun pertussis ptxA promoter region (PT), dan outer membran porin (PO) atau recA (RA) sudah dievaluasi pada spesimen pernafasan yang dikumpulkan dari 4.442 pasien dengan dugaan pertussis.

Semua spesimen diperoleh dari pasien dengan dugaan pertussis dari King Country, Washington, yang dirujuk ke Laboratorium Mikrobiologi pada Rumah Sakit Anak dan Pusat Kesehatan Wilayah (CHRMC), Seattle, WA, antara Januari 2002 sampai Desember 2005. Kultur hanya dilakukan pada spesimen PCR positif dan PCR indeterminate. Dua swab Dacron atau rayon nasofaring diperoleh, satu diletakkan disamping ReganLowe transpor medium untuk kultur yang menunggu hasil PCR dan yang lainnya disimpan pada suhu 20⁰C dalam tube steril tanpa tarnspor aditif. Swab yang paling akhir diproses dengan menambahkan 1 ml garam steril, diikuti 30s campuran vigorous vortox. Suspensi garam dipindahkan ke 1,5 ml tube Eppendort dan disentrifuse pada 1160 x g selama 5 menit, dan butir-butir dihentikan pada 100 ml tingkat molekuler air (Fischer Scientific, Fair lawn, NJ) dan dipanaskan pada 95⁰C selama 5 menit dan didinginkan pada 4⁰C. Amplifikasi dalam kontrol positif terdiri dari organisme baru tumbuh diencerkan menjadi 1 : 10 dan 1 : 100 dan 0.5 suspensi McFarland pada B. pertussis ATCC 9340 dan B. parapertussis ATCC 15237. Sensitivitas PCR untuk IS< PT, dan PO/RA sudah divalidasi pada batas pemeriksaan rendah 20 CFU. Inokulum akhir dari pemanasan bahan kontrol B. pertussis ATCC 9340 menggunakan pengenceran ujung akhirnya dapat menjamin jumlah kopi genom sedikitnya 50 per reaksi pada tiap tes yang dilakukan. Air pada tingkat molekuler telah digunakan untuk kontrol negatif dan penanda b–aktin manusia telah digunakan untuk mengontrol kualitas spesimen dan hambatan PCR.

Ui PCR didesain untuk mendeteksi tiga target independen pada genom Bordetella : chromosomal repeated insersion sequence IS 481 (IS), racub polimorfis pertussis ptxA promoter region (PT), dan recA (RA) gene coding region, selama periode pertama penelitian gen outer membran porin (PO) digunakan sebelum sekuen RA tersedia.

Pertussis yang terdeteksi oleh tiga target IS-PT-PO/RA PCR adalah pada 309 pasien dan 247 pasien terdeteksi oleh konvensional single target IS. Dibandingkan dengan single target IS kombinasi tiga target meningkatkan proporsi spesimen positif 1,25 kali lipat dan kombinasi 2 target meningkatkan proporsi spesimen positif 1,10-1,24 kali lipat. Sembilan kasus infeksi B. parapertussis dilaporkan berdasarkan pengunaan multitarget PCR ini.